OKM_PI_605_VIR genotypizace HCV GEN-C
	Pracovní instrukce/Instrukce pracovní systému kvality
	číslo dokumentu	: OKM_PI_605
	verze dokumentu	: 01
	platí od	: 07.02.2019
	sestaveno	: 16.04.2021

Centrální laboratoře Fakultní nemocnice Bulovka, Budínova 67/2, 180 81 Praha 8

Genotypizace HCV – Reverse Hybridization Strip Assay GEN-C 2.0
(AC004/24, výrobce NUCLEAR LASER MEDICINE s.r.l., distributor Genetica s. r. o.

Diagnostický kit Reverse Hybridization Strip Assay GEN-C 2.0 je určen ke genotypizaci HCV pomocí reverzní hybridizace na stripech. Jednotlivé genotypy jsou rozlišeny na základě variací v 5´-UTR a Core oblasti genomu HCV. Test rozlišuje genotypy 1-7 a jejich subtypy.

Test navazuje na reverzní transkripci a amplifikaci příslušných úseků RNA HCV pomocí vyšetřovacího kitu NLM HCV RT-PCR 2,0. Tato část vyšetření se provádí v laboratoří PCR.

Genotypy HCV se vyšetřují jednou týdně dle potřeby a nastřádání potřebného počtu vzorků.

Hybridizace (46 °C)

1. Předehřát roztoky hybridizační (Hybridization , KA102, 60 ml) a promývací (Stringent Wash Solution, KA928, 175 ml) v termostatu (37° C) po dobu cca 60 minut.

2. Nastavit Termomixer – teplota 46 °C, čas 30 minut, MIX, (300 rpm), ohřeje se do 5 minut

3. Pomocí čisté pinzety vyjmout proužek pro každý vzorek, na matné straně označit tužkou (pořadí vzorku)

4. Vzorky intenzivně promíchat o hranu míchadla

5. Do vaničky do každé dráhy napipetovat 10 µl roztoku DNAT (Denaturation solution containing NaOH, KA107, 1 ml, modrá zkumavka), do „modré kapky“ probublat 10 µl vzorku

6. Inkubovat 5 minut při pokojové teplotě („nechat stát“)

7. Přidat 1 ml předehřátého hybridizačního pufru (pro každý vzorek nová špička s filtrem kvůli kontaminaci!), lehkým kýváním promíchat

8. Vložit stripy označenou stranou nahoru, ponořit!

9. Vložit do termomixeru, zaklopit, STARTSTOP - 30 minut inkubovat při 46 °C

Promývání (46 °C)

1. Vyjmout destičku z termomixeru, odsát roztok vodní vývěvou

2. Přidat 1 ml předehřátého promývacího roztoku Stringent Wash Solution, zakývat a vylít

3. Přidat 1 ml předehřátého promývacího roztoku Stringent Wash Solution (roztok vložit znovu do termostatu!).

4. Inkubovat 15 minut při 46 °C v termomixeru.

5. Odstranit roztok, přidat 1 ml předehřátého promývacího roztoku Stringent Wash Solution

6. Inkubovat 15 minut při 46 °C v termomixeru

7. Odstranit roztok

Obarvení (pokojová teplota)

1. Nastavit termomixer na 25° C, odklopit, nechat zchladnout

2. Přidat 1 ml roztoku konjugátu (Conjugate, KA574, 60 ml), na každý vzorek novou špičku!

3. Inkubovat 15 minut při pokojové teplotě s protřepáváním (třepat odkryté)

4. Odstranit roztok vylitím, přidat 1 ml promývacího roztoku B (Wash Solution B, KA105-1, 175 ml), krátce promíchat zakýváním a vylít

5. přidat 1 ml promývacího roztoku B, inkubovat 5 minut při pokojové teplotě s protřepáváním

6. odstranit roztok, přidat 1 ml promývacího roztoku B inkubovat 5 minut při pokojové teplotě s protřepáváním

7. odstranit roztok, přidat 1 ml substrátu (Color developer, AA564, 60 ml, hnědá lahvička), roztok je pěnivý, na každý vzorek nová špička

8. inkubovat 15 minut ve tmě při pokojové teplotě s protřepáváním

9. odstranit roztok, omýt strip střičkou s destilovanou vodou

10. stripy usušit na savém papíře ve tmě cca 1 hodinu, nalepit na výsledkový formulář a vyhodnotit.

Vyhodnocení (viz hodnotící formulář OKM_F_104 genotypizace HCV GEN-C)

Vyhodnocení nabarvených stripů a určení genotypů se provádí porovnáním počtu a polohy proužků na stripu s transparentní dekódovací kartou z kitu a vyhodnocením dle interpretační tabulky v návodu výrobce. Kontrola kvality je pro každý vzorek monitorována kontrolními proužky na každém stripu.

Postup při vyhodnocení:

1) přiložit dekódovací kartičku ke stripu tak, aby si odpovídaly modré a červené značky

2) zkontrolovat, zda jsou na stripu viditelné 3 kontrolní proužky

3) odečíst čísla jednotlivých proužků viditelných na stripu. Proužky jsou číslovány 1 až 18. Zapsat do pracovního listu.

4) k vyhodnocení použít interpretační tabulky A (5´UTR region) případně B (CORE region):

Pokud podle tabulky A (5´UTR region- proužky 1-13) odpovídá výsledek genotypu 2,3,4,5, 6a-b nebo 7a, nepokračujeme s analýzou CORE regionu (proužky 14-18 mohou být viditelné, ale nesmí být v tomto případě použity k vyhodnocení).

Pokud podle tabulky A (5´UTR region) odpovídá výsledek genotypu 1 nebo 6c-q musíme pokračovat v analýze pomocí tabulky B (CORE region - proužky 14-18) a konečný výsledek určíme pouze na základě hodnocení CORE regionu (např. pokud podle 5´UTR region určíme genotyp 1b, ale podle CORE regionu 1a, konečný výsledek je 1a)

Podrobněji viz příbalový leták.

Tabulka A

Interpretační tabulky k určení genotypů na základě přiřazení čísel proužkům na stripech

(NLM diagnostici, Itálie, Rev.6 14/07/2017)

Tabulka B